3种核心策略+2个权威文献案例：AAV神经环路示踪怎么做才高效？

• AAV凭借低毒性、高特异性的优势，已经成为神经环路示踪研究中最常用的工具之一
• 不同血清型AAV的靶向性差异极大，针对不同的示踪方向需要选择对应血清型
• 成熟的稀疏标记、GRASP突触标记系统，可实现高分辨率的神经环路结构解析

做神经环路研究的第一步，就是清晰解析环路的结构连接，传统的标记方法效率低、背景高，而AAV凭借自身尺寸小、对神经元毒性低、可以长期表达等优势，已经成为目前示踪研究的首选工具。

一、AAV神经环路示踪的血清型怎么选？

不同衣壳血清型的AAV对不同组织、细胞类型的嗜性差异极大，选择错血清型几乎意味着实验的失败。下表整理了目前神经环路示踪领域最常用的AAV血清型及其适用场景：

二、AAV神经环路示踪的核心应用案例

1.逆向跨单级突触标记案例（PMID: 30801002）

该研究目的是解析上游核团投射到腹侧被盖区多巴胺能神经元的环路结构，团队采用了经典的WGA-Cre逆向跨单级突触策略。

实验设计中，选择了AAV-hSyn-DIO-hM4Di(Gi)-mCherry-IRES-WGA-Cre，WGA会介导Cre重组酶从轴突末端跨突触传递到下游目标脑区的神经元，启动DIO系统的表达，从而特异性标记上游投射到目标脑区的特定类型神经元。

实验最终清晰标记了上游PrL脑区到VTA多巴胺能神经元的投射神经元，标记效率高、非特异性信号低，成功解析了该环路在情绪调控中的作用。和元生物可提供该实验用到的AAV载体，载体现货发货快，大大缩短实验周期。

2.顺向跨单级突触标记案例（PMID：36496505）

顺行跨突触示踪可以追踪标记神经元的下游支配神经元，亦可以揭示不同区域神经元之间的突触连接。

单纯疱疹病毒 1 型 (HSV-1) 菌株 H129 (H129) 具有以顺向跨神经元传递为主的特征，已广泛用于顺行跨突触神经追踪，随着科学家们对其改造开发了一系列顺行跨单级突触的示踪病毒，如HSV-1-H129-dTK-T2，H129-dgK-G4和H129Amp- Cre-TK-GFP等，前两者均需辅助病毒AAV helper补充TK或gk，完成顺行跨单级突触示踪；后者需要HSV helper H129-dTK-T2-pacflox辅助下实现快速跨一级突触感染二级神经元的目的。HSV-1 H129株主要以顺行传播，但不是一个非常严格的顺行示踪病毒，其具有轴突末端吸收的天然特性，可以通过轴突末端摄取感染上游神经元，表现出逆行标记。因此，在使用 HSV-1 H129 解剖输出神经网络时，需要控制好参数，尽量避免逆行示踪。

3. GRASP突触特异性标记案例

如果需要标记两个神经元之间直接的物理突触连接，GRASP技术是目前最常用的方案，其原理是将GFP拆分成两个无荧光的片段，分别表达在突触前和突触后神经元，只有两个细胞形成突触时，两个片段才会结合形成完整的有荧光的GFP，从而实现突触连接的特异性标记。

三、常见问题解答

1. AAV示踪和HSV、RV示踪比有什么优势？

AAV对神经元的毒性远低于RV和HSV，可以实现长期示踪，适合需要观察长时间维度变化的研究，而且AAV的装载容量灵活，可以同时携带示踪标记和功能调控元件，比如光遗传、化学遗传元件，可以在解析环路结构的同时开展功能研究，这是其他病毒很难做到的。

2.做跨突触示踪需要多高滴度的AAV？

一般来说，跨突触示踪需要的AAV滴度不低于1×10^13 vg/mL，滴度不够会导致跨突触效率极低，无法标记阳性细胞，和元生物提供的AAV跨突触示踪产品滴度都稳定在1×10^13 vg/mL，满足跨突触示踪的需求。

3.可以定制特定元件的AAV示踪载体吗？

当然可以，一般从载体构建、包装到滴度测定的全套AAV定制服务，支持各种特殊启动子、标记元件的克隆包装，最快7天就能出货，全力保障项目进度。

下一步行动建议

如果你正在准备开展神经环路示踪相关的实验，可以先梳理清楚你的示踪方向、靶细胞类型，和元的AAVneO新血清型发现系统还在持续开发更具特异性的新型AAV血清型，未来还会有更多适合特殊示踪需求的工具推出，帮助大家更快发表高质量成果。