一、COVID-19多器官单细胞与空间转录组图谱的构建
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）由SARS-CoV-2病毒感染引起，临床表现多样，可从无症状感染发展至重症肺炎乃至死亡。目前认为，急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征以及多器官衰竭等直接并发症是导致COVID-19患者死亡的主要原因。然而，迄今为止，关于COVID-19患者各器官在分子与细胞水平的病理改变仍缺乏深入了解。
Nature杂志在线发表的一项重要研究，题为“COVID-19 tissue atlases reveal SARS-CoV-2 pathology and cellular targets”。该研究整合应用单细胞测序与数字空间谱（DSP）空间转录组技术，系统绘制了COVID-19患者肺、肝、肠等多个器官组织的单细胞图谱及空间图谱，并深入解析了相关基因表达特征，为揭示SARS-CoV-2的病理机制及细胞靶点提供了重要依据。
二、研究总体思路与技术路线
图1：研究思路
图2：实验及分析流程
三、主要研究结果
01 COVID-19患者肺部的单细胞图谱
通过自动细胞类型注释工具，研究者在COVID-19患者肺部组织的单细胞（核）图谱中识别出28种细胞类群，包括实质细胞、内皮细胞及免疫细胞等。与正常肺部组织相比，COVID-19患者肺部的II型肺泡细胞（AT2）数量显著减少，而树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、成纤维细胞及内皮细胞的数量均有所增加。在COVID-19患者的II型肺泡细胞中，多个与宿主病原体反应相关的基因表达上调，而编码肺表面活性物质、具有抑制肺纤维化功能的基因则表达下调。
在COVID-19患者的肺细胞中，PATS（Pre-alveolar type 1 transitional cell state）基因表达更为显著。部分PATS细胞同时表达KRT8/CLDN4/CDKN1A及KRT5/TP63/KRT17基因，提示这些细胞可能为TP63阳性肺内基底样组细胞（Intrapulmonary basal-like progenitor cells, IPBLP），在肺泡严重受损时作为储备细胞发挥作用。基于上述发现，研究者提出了肺泡上皮细胞再生的模型：（1）在健康肺泡中，II型肺泡细胞可通过自我更新维持自身群体，并经由转分化过程转化为I型肺泡细胞；（2）在COVID-19患者的肺泡中，II型肺泡细胞的自我更新及其向I型肺泡细胞的转分化均受到抑制，导致PATS细胞累积，同时远端气道中的IPBLP细胞开始向肺泡区域迁移。
图3：COVID-19 患者肺部单细胞（核）图谱
02 肺细胞中SARS-CoV-2病毒RNA的富集分析
与既往研究一致，本研究发现新冠病毒载量（Viral load）与患者从症状出现至死亡的时间呈负相关。在肺部不同细胞类型中，髓系细胞（Myeloid cells），特别是CD14high CD16high炎性单核细胞及LDB2high OSMRhigh YAP1high巨噬细胞，含有更高水平的SARS-CoV-2病毒RNA。值得注意的是，这些表达病毒RNA的细胞并不同时表达ACE2、TMPRSS2等病毒进入相关因子。
图4：吞噬细胞和内皮细胞富集 SARS-CoV-2 病毒的RNA
03 COVID-19患者肺部的空间转录组图谱
研究者采用数字空间分析（Digital Spatial Profiling, DSP）技术构建了尸检样本肺部组织的空间转录组学图谱。结果显示，在上皮细胞（PanCK+）区域中，I型与II型肺泡细胞占据主导地位。在非上皮细胞（PanCK-）区域中，COVID-19患者较非COVID-19对照表现出更多的成纤维细胞及肌成纤维细胞。
比较COVID-19患者与非COVID-19对照肺部相应感兴趣区域（AOIs）发现，COVID-19患者肺组织中干扰素-α与干扰素-γ响应基因及氧化磷酸化相关基因表达显著升高，而TNFα、IL2-STAT5及TGF信号通路、顶端连接及缺氧通路相关基因表达则显著下降。
在同一尸检样本中，比较发炎与未发炎的AOIs区域，结果显示发炎区域中先天免疫及炎症相关基因表达显著增加，而Claudins及紧密连接通路相关基因表达下降。
进一步比较COVID-19患者肺部病毒含量高与低的AOIs区域，发现病毒基因ORF1ab及S基因被诱导表达，趋化因子基因（CXCL2与CXCL3）表达显著上升。值得关注的是，NT5C基因在病毒含量高的AOIs区域中亦显著上调，目前该基因在肺损伤中的具体作用尚不明确，有待进一步研究。
图5：COVID-19 患者肺和正常肺，COVID-19 患者肺感染区和非感染区细胞组成和基因表达比较
04 COVID-19对心脏、肾脏及肝脏细胞组成的影响
在COVID-19尸检样本的肝脏、心脏及肾脏单细胞核图谱中检测到少量SARS-CoV-2病毒RNA，这可能与单细胞核RNA检测方法有关，后续可通过DSP及RNAscope等技术进行验证。比较COVID-19患者与正常对照心脏组织的单细胞核图谱发现，COVID-19患者心肌细胞及周细胞比例显著降低，而血管内皮细胞比例显著增加。心肌细胞、周细胞及成纤维细胞中上调的基因包括PLCG2与AFDN。在这些细胞类型中，上调的通路涉及氧化应激诱导的细胞凋亡、细胞黏附与免疫通路及细胞分化通路。
图6：COVID-19 患者心脏、肝脏肾脏单细胞（核）图谱
四、结论
综上所述，本研究综合应用单细胞测序技术与数字空间分析（DSP）空间转录组测序技术，系统构建了COVID-19患者肺、肾、肝及心脏组织的单细胞（核）图谱，以及肺部的空间转录组图谱。在此基础上，研究进一步结合COVID-19全基因组关联分析（GWAS）数据，识别出与新冠肺炎遗传风险相关的具体细胞类型。上述单细胞及空间图谱为深入理解SARS-CoV-2导致人体器官衰竭乃至最终死亡的病理机制提供了重要的数据基础和理论依据。
