01研究背景
子宫内膜癌中LATS1/2的高频突变与MHC-I表达下调的关联，提示了这两个Hippo通路核心激酶可能参与了免疫调控。然而，传统认知中LATS1/2主要通过磷酸化YAP/TAZ发挥作用，其是否以及如何调控MHC-I表达完全未知。STAT1作为干扰素信号通路的核心转录因子，已知可被JAK1/2磷酸化Tyr701，但其Ser727的磷酸化调控机制一直不明确。这两条线索交汇，催生了一个关键科学问题：LATS1/2是否直接磷酸化STAT1，从而影响MHC-I的表达？
02验证策略
第一步：建立互作关系（细胞层面证据）。
研究团队首先在细胞环境中验证了LATS1/2与STAT1的物理相互作用。
内源性互作：在KLE子宫内膜癌细胞中，使用特异性抗体成功共沉淀出内源性LATS1/2-STAT1复合物；
外源性验证：293T过表达系统中，FLAG-LATS1/2与MYC-STAT1的双向免疫共沉淀确认互作特异性；
排除间接效应：后续的GST pull-down实验证明这种互作是直接的，无需其他哺乳动物蛋白辅助。
第二步：功能相关性验证（细胞表型关联）。
磷酸化水平检测：LATS1/2敲除显著降低细胞内STAT1 Ser727的基础及干扰素γ诱导的磷酸化水平；
功能挽救实验：回补野生型LATS1/2可恢复磷酸化，而激酶死亡突变体无效；
抑制剂验证：LATS1/2特异性抑制剂TDI-011536处理产生类似敲除效果。
图1 验证LATS1/2可催化STAT1蛋白磷酸化（Yang et al., 2025）。
03 核心突破：体外激酶实验的设计与执行
1.蛋白制备策略
激酶选择：表达纯化LATS1/2的催化结构域（LATS1: 589-1130aa；LATS2: 480-1088aa），确保激酶活性
底物设计：采用STAT1全长蛋白及分段策略（N端1-650aa，C端650-750aa），精确定位磷酸化区域
2.反应体系优化
标准激酶缓冲液：20mM Tris-HCl (pH 7.5)，5mM MgCl₂，5mM MnCl₂，2mM DTT
ATP浓度：10μM生理相关浓度
反应条件：30℃孵育30分钟，确保线性反应阶段
3.磷酸化位点鉴定
（1）质谱分析：将反应产物进行LC-MS/MS分析；鉴定到C端肽段TALISPMGSPR（S727磷酸化），首次发现N端肽段VLDGSLQEIQR（S532磷酸化）；
（2）免疫印迹验证：使用p-STAT1（S727）特异性抗体，只有当LATS1/2存在时，STAT1的S727位点才发生磷酸化。
参考文献
1、Yang Q, Lv Z, Wang M, et al. LATS1/2 loss promote tumor immune evasion in endometrial cancer through downregulating MHC-I expression[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2024, 43(1): 54.
