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荧光原位杂交
(FISH) 技术
荧光原位杂交 (简称 FISH)——一种重要的细胞遗传学技术，该技术用于获取空间基因组和转录组信息。FISH 广泛应用于基因组学和细胞生物学研究，以及预防医学、生殖医学和肿瘤学等领域的诊断应用。
它是检测染色体异常的金标准技术！
基本原理
荧光原位杂交是一种用于检测和定位染色体上特定 DNA 序列的实验室技术。该技术将个体的全套染色体固定在载玻片上，然后用 "探针" (一小段标记有荧光染料的纯化 DNA)进行染色。荧光标记的探针会找到并结合染色体上的对应序列。借助专用显微镜，可以观察到荧光探针结合的染色体及其亚染色体区域。常用来确定结合了荧光探针的 DNA 区域、RNA 分子在染色体及其他细胞器中的定位 (图 1)。
图 1. 荧光原位杂交技术原理示意图[1]。
技术优势
? 高灵敏度与特异性：可精准检测并定位目标核酸序列，即便处于复杂细胞环境中，也能有效区分目标序列与非目标序列。
?支持多色荧光标记：能够同时检测多个目标序列，显著提升检测效率与准确性。
?直观可视化效果：借助荧光显微镜，可直接观察目标序列在细胞或组织内的分布及定位情况。
?适用范围广泛：可应用于分裂与非分裂细胞，能够检测隐性基因缺失、基因易位及低水平基因嵌合体，且可在石蜡包埋组织 (PET) 切片上进行操作。
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实验流程
FISH 实验的核心步骤为：样品制备 →预处理 →杂交 →洗涤 →复染与封片 →荧光显微镜观察与分析。
其中，样品预处理的关键在于暴露细胞或组织内的核酸，以确保探针有效结合，这一过程通常涉及蛋白酶消化与梯度乙醇脱水操作。组织预处理步骤见图 2。
图 2. 新鲜冷冻组织与多聚甲醛固定组织的组织预处理步骤并行工作流程[2]。
组织预处理完成后，使用疏水屏障笔对载玻片上的组织进行包膜处理 (圈画)，随后置于蛋白酶溶液中室温孵育。洗涤后，将组织转移至台式培养箱杂交 2 小时，再依次进行扩增步骤。完成 FISH 探针处理后，组织需先进行洗涤，再用正常马血清封闭。一抗孵育在 4°C 条件下过夜进行，以确保抗体与抗原的充分结合；二抗孵育则在室温下持续 2 小时 (图 3)。
图 3. FISH 探针操作流程示意图[2]。
实验Protocol (供参考[3])
1. 制备标记有 DIG (或 FITC 等其他标记)的反义探针。
2. 对组织进行解剖，用 4% 磺酸钠溶液固定，并在 20% 蔗糖溶液中进行冷冻保护处理，然后迅速冷冻。
3. 切割冷冻切片，并将其收集在防脱载玻片上。让其干燥。
4. 将标记探针稀释至杂交缓冲液中的 1/1000 倍浓度。每张载玻片加入至少 300 微升，然后在上面放置一块干燥盖玻片，以使溶液均匀分布在切片上。
5. 在加湿的培养箱中于 65°C 下孵育过夜。
6. 移去盖玻片，在 MABT 缓冲液中洗涤 2 次，每次 5 分钟。
7. 接着在 65°C 下用 65°C 洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次30 分钟。
8. 用 MABT 缓冲液洗涤2次，每次 5 分钟。
9. 用封闭液封闭 1 小时。
10. 将 AP-Anti-Dig 抗体稀释至封闭溶液中的 1/1500 倍浓度 (对于与过氧化物酶结合的抗体则为 1/500)。每张载玻片加入 500 微升，于 4°C 下孵育过夜。
11. 在 MABT 缓冲液中洗涤 3 次，每次 10 分钟。
12. 在 pH 9.8 的预显色缓冲液中短暂洗涤 (2 分钟即可)。
13. 在 pH 9.8 的显色缓冲液(含 5% PVA 和 NBT/BCIP) 中于 37°C 下孵育，让蓝色荧光达到到所需的强度 (2 小时至过夜)，然后用自来水冲洗以终止反应。
14. 进行脱水处理，并用二***基基质进行封片。
15. 使用荧光显微镜观察样品，识别并定位荧光信号。
相信涉及该实验的小伙伴大部分都会师承同门，先从“打下手” 的小跟班做起，再对着师兄师姐的实验记录本 “咔嚓” ，出师，迫不及待亲自尝试一番！
我知道你急，但咱先别急。上述只介绍了组织的处理步骤，如果你的样本是细胞，还是要乖乖做细胞爬片喔~
表1. FISH探针的主要类型。
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FISH 的技术联用
mRNA FISH-IHC
mRNA FISH 和 IHC 成像结合可用于表征 AD 模型中补体靶向疗法的疗效，或结合其他与阿尔茨海默病病理相关的蛋白聚集体 (如 tau、突触核蛋白) 研究基因表达。
『案例』：结合 FISH 和 IHC 检测小鼠大脑中淀粉样斑块胶质补体表达
补体蛋白可促进阿尔茨海默病 (AD)的神经退行性病变，这类蛋白由包围 β- 淀粉样斑块的胶质细胞分泌。为此，作者提出了一种基于酪酰胺-地高辛(Tyramide-digoxigenin) 信号扩增技术的 Aβ 斑块检测优化方案 (如图 4)。该方案结合多重 mRNA 原位荧光杂交 (FISH) 技术，用于检测 TauPS2APP 小鼠模型中 Aβ 斑块近端区域胶质细胞特异性的补体表达情况。结果表明，通过信号放大处理，在连续的 FISH-IHC 实验中可获得更高的信噪比，并实现对弥漫性 Aβ 斑块的灵敏检测 (如图 5)。
FISH-Flow
FISH-Flow 技术通过将荧光寡核苷酸与 RNA 杂交，借助流式细胞术实现单细胞层面的荧光定量分析。
『案例』：FISH-Flow 用于定量小鼠和人类细胞中新生和成熟核糖体 RNA。
研究人员开发了一种 FISH-Flow 方法，可用于定量小鼠和人类细胞中新生的 47S rRNA 以及成熟的 18S 和 28S rRNA，该方法还能结合 DNA 染色技术，完成跨细胞周期阶段的 rRNA 定量检测 (如图 6)。
无论是新生的还是成熟的核糖体 RNA 在细胞中都十分丰富。因此，如图 7A 所示，针对 rRNA 的 FISH 探针具有较高的信噪比。用 DNA 结合的 DAPI 染料进行染色，可将细胞群体分为 G1/S/G2-M 期，并对细胞周期各阶段的 rRNA 进行定量，如图 7B 所示。
序列荧光原位杂交 (seqFISH)
序列荧光原位杂交 (seqFISH，sequential fluorescence in situ hybridization) 是一种先进的生物分子分析方法，将成像技术与组合分子条形码技术相结合，利用已知序列的探针，对细胞/组织内的全 RNA 做多轮杂交成像，通过分析探针两臂区域 barcode 的荧光信号组合来判断基因 ID，讲特定位置信息与基因 ID 关联生成图像。seqFISH 方法能够在原生组织和器官环境中获得高分辨率的细胞类型、状态、和邻域关系信息 (图 8)。
图 8. Stereo-seq 流程[6]。
步骤 1，设计 DNB 模式化阵列芯片。步骤 2，原位测序以确定唯一条形码寡核苷酸的空间坐标。步骤 3，通过将含 UMI-polyT 的寡核苷酸连接到每个点来制备捕获探针。步骤 4，从组织中进行原位 RNA 捕获。步骤 5，cDNA 扩增、文库构建和测序。步骤 6，数据分析。
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诺奖得主的最新研究：
smLiveFISH
就在今年！诺贝尔化学奖得主、CRISPR 基因编辑技术先驱 Jennifer Doudna 教授团队在Nature Biotechnology期刊发表了题为 “Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm” 的研究论文。该团队开发出一种单分子活细胞荧光原位杂交技术 (Single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization，smLiveFISH)。
smLiveFISH
【单分子活细胞荧光原位杂交技术】
该技术借助嗜热链球菌来源的 RNA 靶向 III-A 型 CRISPR-Csm 系统及多重向导RNA，使研究人员能够在包含原代细胞在内的多种细胞类型中，直接且高效地实现单个 RNA 分子的可视化，进而追踪不同种类活细胞中单个 mRNA 分子的动态轨迹 (图 9)。
图 9. smLiveFISH 系统的工作示意图[7]。
如图所示，GFP 标记的 Csm 复合物标记单个 NOTCH2 mRNA (图 10 a 和 b 左图)，smFISH 探针标记 NOTCH2 mRNA (图 10 a 和 b 中图)，两者的叠加图像显示共定位情况 (图 10 a 和 b 右图)。Csm 复合物病灶与 smFISH 病灶的共定位比例、以及具有 Csm 复合物标记病灶的转染细胞比例均可进行量化 (图 10c-d)。
图 10. 利用 smLiveFISH 对天然单个 mRNA 分子进行成像[7]。
通过双色成像验证，Csm 复合物成功标记内源性 NOTCH2 mRNA，并在多种细胞类型中实现稳健检测，且未对 mRNA 的稳定性、衰变速率、定位及蛋白质表达产生影响。此外，smLiveFISH 技术也成功标记 MAP1B mRNA，通过共定位实验验证了信号的准确性，同时揭示其在细胞外围富集的空间分布特征，且同样未干扰 mRNA 的稳定性、衰变速率、定位及蛋白质表达，进一步证明该技术适用于不同 RNA 分子的可视化研究。
MCE 可以根据客户需求提供 FISH 探针的设计和定制服务，进行相关的检测服务(纯度、序列和结构分析等)，确保产品的有效性与一致性，始终保证优质高效的服务品质！
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[1] Debnath, et al. Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities.Springer.2010;153-170.
[2] Dereli AS, et al. Combining Multiplex Fluorescence in situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections. J Vis Exp. 2021 Jun 25;(172).
[3] N.P. Pringle. et al. In situ hybridization protocols. https://www.ucl.ac.uk/%7Eucbzwdr/In%20Situ%20Protocol.pdf
[4] Rao S, et al. Protocol for detection of glial complement expression in relation to amyloid plaques in mouse brain with combined FISH and IHC. STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103388.
[5] Antony C, et al. FISH-Flow to quantify nascent and mature ribosomal RNA in mouse and human cells. STAR Protoc. 2023 Sep 15;4(3):102463.
[6] Chen A, et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 2022 May 12;185(10).
[7] Xia C, et al. Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR-Csm. Nat Biotechnol. 2025 Feb 18.
